Блог

Mar 07, 2023

Параллельное секвенирование внехромосомных кольцевых ДНК и транскриптомов в одиночных раковых клетках

Природная генетика, том 55,

Nature Genetics, том 55, страницы 880–890 (2023 г.) Процитировать эту статью

8449 Доступов

159 Альтметрика

Подробности о метриках

Внехромосомные ДНК (вкДНК) часто встречаются при раке, но многие вопросы об их происхождении, структурной динамике и влиянии на внутриопухолевую гетерогенность до сих пор не решены. Здесь мы описываем одноклеточную внехромосомную кольцевую ДНК и секвенирование транскриптома (scEC&T-seq), метод параллельного секвенирования кольцевых ДНК и полноразмерной мРНК из отдельных клеток. Применяя scEC&T-seq к раковым клеткам, мы описываем межклеточные различия в содержании вкДНК, одновременно исследуя их структурную гетерогенность и влияние на транскрипцию. Содержащие онкоген вкДНК клонально присутствовали в раковых клетках и вызывали различия в межклеточной экспрессии онкогенов. Напротив, другие небольшие кольцевые ДНК были эксклюзивными для отдельных клеток, что указывает на различия в их отборе и размножении. Межклеточные различия в структуре вкДНК указывают на циркулярную рекомбинацию как механизм эволюции вкДНК. Эти результаты демонстрируют scEC&T-seq как подход к систематической характеристике как малых, так и больших кольцевых ДНК в раковых клетках, что облегчит анализ этих элементов ДНК при раке и за его пределами.

Измерение нескольких параметров в одних и тех же клетках является ключом к точному пониманию биологических систем и их изменений во время заболеваний1. В случае кольцевых ДНК крайне важно интегрировать информацию о последовательностях ДНК с измерениями результатов транскрипции, чтобы оценить их функциональное влияние на клетки. В клетках человека можно выделить по крайней мере три типа кольцевых ДНК2,3,4,5: (1) небольшие кольцевые ДНК (<100 т.п.н.)6, которые описаны под разными названиями, включая эккДНК6, микроДНК4, апоптотические кольцевые ДНК6, малые полидисперсные кольцевые ДНК7 и теломерные кольцевые ДНК или С-кольца8; (2) круги вырезания Т-клеточных рецепторов (TREC)9; и (3) большие (>100 т.п.н.) онкогенные кольцевые внехромосомные ДНК с амплифицированным числом копий10,11 (называемые вкДНК и видимые как двухминутные хромосомы во время метафазы12). Несмотря на нашу растущую способность характеризовать множество особенностей в отдельных клетках13, глубокая характеристика содержания, структуры и последовательности кольцевой ДНК в отдельных клетках остается неуловимой с помощью современных подходов.

При раке амплификации онкогенов на вкДНК представляют особый интерес, поскольку они мощно стимулируют гетерогенность числа межклеточных копий благодаря своей уникальной способности реплицироваться и неравномерно разделяться во время митоза14,15,16,17,18,19. Эта гетерогенность позволяет опухолям адаптироваться и уклоняться от терапии2,20,21,22. Действительно, пациенты с раком, содержащим вкДНК, имеют неблагоприятные клинические исходы11. Недавние исследования показывают, что вкДНК, содержащие энхансеры, взаимодействуют друг с другом в ядерных узлах17,23 и могут влиять на отдаленные хромосомные местоположения в транс23,24. Это предполагает, что даже вкДНК, не содержащие онкогены, могут быть функциональными23,24. Более того, недавно мы обнаружили, что опухоли содержат неожиданный репертуар более мелких, нейтральных по числу копий кольцевых ДНК с еще неизвестной функциональной значимостью3.

В этом исследовании мы сообщаем о секвенировании внехромосомной кольцевой ДНК и транскриптома одной клетки (scEC&T-seq), методе, который позволяет параллельно секвенировать все типы кольцевой ДНК, независимо от их размера, содержания и количества копий, а также полноразмерную мРНК в одном клетки. Мы демонстрируем его полезность для профилирования одиночных раковых клеток, содержащих как структурно сложные мультифрагментированные вкДНК, так и небольшие кольцевые ДНК.

Современные подходы к очистке кольцевой ДНК включают три последовательных этапа: выделение ДНК с последующим удалением линейной ДНК посредством расщепления экзонуклеазой и обогащением кольцевой ДНК путем амплификации по катящемуся кругу3,6,25. Мы пришли к выводу, что этот подход можно масштабировать до отдельных клеток, а в сочетании с Smart-seq2 (ссылка 26) он может позволить параллельное секвенирование кольцевой ДНК и мРНК. Чтобы оценить наш метод на отдельных клетках, мы использовали линии клеток рака нейробластомы, которые мы ранее охарактеризовали в массовых популяциях3. Мы использовали FACS для разделения клеток на 96-луночные планшеты (рис. 1а, дополнительные рис. 1а, б и дополнительная таблица 1). ДНК отделяли от полиаденилированной РНК, которая захватывалась на магнитных шариках, связанных с одноцепочечными последовательностями дезокситимидиновых (Oligo dT) праймеров, аналогично предыдущим подходам27. ДНК подвергали расщеплению экзонуклеазой, что успешно проводилось в прошлом в массовых популяциях клеток, для обогащения кольцевой ДНК3,6,25 (рис. 1b). ДНК, подвергнутая воздействию эндонуклеазы PmeI перед расщеплением экзонуклеазой, служила отрицательным контролем3. В некоторых случаях ДНК оставляли непереваренной в качестве дополнительного контроля (рис. 1б). ДНК, оставшаяся после различных режимов расщепления, была амплифицирована. Амплифицированную ДНК подвергали парному секвенированию на Illumina, а в некоторых случаях – секвенированию с длинным считыванием Nanopore (рис. 1а). Был проанализирован состав последовательностей кольцевых ДНК и сделан вывод о геномном происхождении в кольцевых областях с использованием ранее разработанных вычислительных алгоритмов для анализа кольцевых ДНК3.