Блог

Oct 13, 2023

Фиксация метанолом является методом выбора для капельной

Том коммуникативной биологии

Биология связи, том 6, Номер статьи: 522 (2023) Цитировать эту статью

1185 Доступов

24 Альтметрика

Подробности о метриках

Основным важным шагом в транскриптомике одноклеточных клеток является подготовка образцов. Было разработано несколько методов сохранения клеток после диссоциации, чтобы отделить обработку образцов от подготовки библиотеки. Тем не менее, пригодность этих методов зависит от типов клеток, подлежащих обработке. В этом проекте мы проводим систематическое сравнение методов консервации одноклеточной секвенации РНК на основе капель на нервных и глиальных клетках, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Наши результаты показывают, что, хотя ДМСО обеспечивает высочайшее качество клеток с точки зрения количества молекул РНК и генов, обнаруживаемых на клетку, он сильно влияет на клеточный состав и индуцирует экспрессию генов стресса и апоптоза. Напротив, фиксированные метанолом образцы имеют клеточный состав, аналогичный свежим образцам, и обеспечивают хорошее качество клеток и небольшие отклонения в экспрессии. В совокупности наши результаты показывают, что фиксация метанола является методом выбора для проведения экспериментов по транскриптомике отдельных клеток на основе капель на популяциях нервных клеток.

Методы одноклеточной транскриптомики (scRNA-seq) произвели революцию в способах высокопроизводительного изучения экспрессии генов у людей, в тканях и даже при заболеваниях1,2,3. Ранее исследования ограничивались выявлением изменений уровня экспрессии генов в массе, то есть в популяции клеток, составляющих тот или иной образец. Таким образом, эти подходы смешали два разных эффекта: изменения клеточного состава интересующего образца и изменения экспрессии генов внутри отдельных клеток. Теперь scRNA-seq позволяет оценивать эти два эффекта независимо и обнаруживать как изменения в клеточном составе4,5, так и экспрессию генов в определенных типах клеток6,7.

Несмотря на популярность методов scRNA-seq, до сих пор остается нерешенным ряд технических проблем. Например, отделение клеток от ткани и получение хорошей суспензии клеток, необходимой для секвенирования scRNA, является высоко тканеспецифичным и может потребовать использования различных стратегий, включая ферментативное расщепление, механическую дезагрегацию, клеточную активацию флуоресценцией. сортировка и другие технологии8,9,10,11,12. В результате подготовка образцов для scRNA-seq может занять несколько часов, что делает более удобной их обработку в более поздние моменты времени. Помимо технических трудностей, сохранение клеток также важно, если нам необходимо разделить диссоциацию и обработку образцов по другим причинам, таким как отправка образцов на внешнее учреждение, или если мы хотим собрать несколько образцов и обработать их вместе в более поздний момент времени. чтобы сэкономить время или деньги. Во всех этих случаях исследователи хотели бы сохранить эти образцы таким образом, чтобы свести к минимуму различия в клеточном составе и экспрессии генов отдельных клеток по сравнению с исходным образцом. То есть лучшим методом консервации будет тот, который оказывает наименьшее влияние на клеточный состав образца и транскриптомный профиль отдельных клеток.

Уже разработано несколько методов сохранения клеток, позволяющих решить эту проблему и отделить обработку образцов от подготовки библиотеки. Среди них мы находим как самодельные, так и коммерческие решения, включая фиксацию метанолом13,14, дитиобиссукцинимидилпропионат15, криоконсервацию диметилсульфоксида (ДМСО)16,17, уксусно-метаноловый (ACME)10, параформальдегид18, CellCover17 и vivoPHIX19. Эти методы направлены на поддержание состава образца и качества РНК клеток. Тем не менее, учитывая, что подготовка образцов тканеспецифична, мы ожидаем, что разные методы консервации могут быть оптимальными для разных образцов. Многие из этих протоколов были протестированы только на клеточных линиях или на легкодоступных клетках, таких как клетки периферической крови, и поэтому неясно, какова их эффективность в клетках, которые трудно диссоциировать или которые потенциально повреждаются во время диссоциации. В частности, ни один из предыдущих методов не был протестирован на зрелых нейронах или нейронах, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC), которые являются основным источником нервных клеток для изучения молекулярных механизмов, вызывающих неврологические заболевания20.