Блог

Oct 14, 2023

Новый стереологический метод оценки количества клеток в 3D коллагеновых каркасах

Научные отчеты, том 13,

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 7959 (2023) Цитировать эту статью

485 Доступов

Подробности о метриках

Современные методы оценки пролиферации клеток в 3D-каркасах основаны на изменениях метаболической активности или общей ДНК, однако прямая количественная оценка количества клеток в 3D-каркасах остается сложной задачей. Чтобы решить эту проблему, мы разработали беспристрастный стереоологический подход, который использует систематически-случайную выборку и тонкие оптические срезы каркасов в фокальной плоскости с последующей оценкой общего числа клеток (StereoCount). Этот подход был проверен на основе косвенного метода измерения общей ДНК (содержания ДНК); и счетная камера Бюркера, текущий эталонный метод количественного определения количества клеток. Мы оценили общее количество клеток для плотности посева клеток (клеток на единицу объема) по четырем значениям и сравнили методы с точки зрения точности, простоты использования и затрат времени. Точность StereoCount заметно превосходила точность содержания ДНК для случаев с ~ 10 000 и ~ 125 000 клеток на каркас. Для случаев с ~ 250 000 и ~ 375 000 клеток/каркас как StereoCount, так и содержание ДНК показали меньшую точность, чем Бюркера, но не отличались друг от друга. С точки зрения простоты использования у StereoCount было большое преимущество благодаря выходу в виде абсолютного количества клеток, а также возможности обзора распределения клеток и будущего использования автоматизации для высокопроизводительного анализа. В совокупности метод StereoCount представляет собой эффективный подход для прямого количественного определения клеток в трехмерных коллагеновых каркасах. Его главное преимущество заключается в том, что автоматизированный StereoCount может ускорить исследования с использованием 3D-матриц, направленных на поиск лекарств для лечения широкого спектра заболеваний человека.

Количественная оценка количества клеток в определенном объеме является важным показателем для мирового сообщества биологов и доклинических исследователей. В дисциплинах, включающих дисперсию клеток в трехмерные объемы, например трехмерные коллагеновые каркасы, для запуска экспериментов необходимы надежные оценки клеток, т.е. посев клеток и оценка гибели и пролиферации клеток с течением времени. Подсчет количества клеток в этих случаях ограничивается двумя основными подходами: камера Бюркера для прямого подсчета клеток из гомогенных клеточных суспензий (жидкая фаза); и подходы на основе флуоресценции для оценки общей ДНК, например CyQuant®1,2. Недостатками подхода с использованием тотальной ДНК являются лизис клеток в результате предварительной обработки образца, такой как расщепление каркаса коллагеназой, и необходимость калибровочной кривой для каждого эксперимента, чтобы гарантировать правильное считывание и корреляцию между линейностью интенсивности сигнала и количеством клеток. Таким образом, не существует прямого количественного метода оценки количества клеток в 3D каркасах.

Чтобы решить эту проблему, мы представляем StereoCount™, новый стереологический метод для прямого количественного определения абсолютного количества клеток в трехмерных коллагеновых каркасах (рис. 1).

Трехмерный коллагеновый каркас, засеянный клетками и используемый для количественного определения количества клеток.

Мы демонстрируем подход с использованием флуоресцентной микроскопии с последующим оптическим срезом и анализом изображений, как подробно описано в разделе «Материалы и методы» и на рисунке 2. Во-вторых, чтобы избежать систематической ошибки, вызванной ручным подсчетом, и повысить производительность, мы вводим автоматизированный рабочий процесс с использованием FIJI-ImageJ3, который использует два макроскрипта и промежуточный шаг на основе поверхностного машинного обучения (NL). Среди преимуществ этого метода следует отметить, что метод не требует расщепления каркаса или секционирования на микротоме и, поскольку подход на основе микроскопа, обеспечивает обзор распределения клеток в каркасе в качестве дополнительной информации. Здесь мы сравниваем и противопоставляем StereoCount методу содержания ДНК, основанному на флуоресцентном обнаружении тотальной ДНК; и подсчет клеток с использованием метода счетной камеры (Бюркера), в целом надежного метода количественного определения клеток.

Процедура отбора проб StereoCount во время микроскопии. Трехмерные (3D) коллагеновые каркасы отбираются в 9 полей зрения XY и 30 Z-стеков. Количество клеток определяют для каждого столбца с помощью оптического сканирования в тонкой фокальной плоскости (метод оптического дисектора). Количество клеток из колонок пересчитывается на весь объем коллагенового каркаса.