Блог

May 15, 2023

Высокий

Том «Природные коммуникации»

Nature Communications, том 14, номер статьи: 2734 (2023) Цитировать эту статью

8080 Доступов

20 Альтметрика

Подробности о метриках

Фиксированные формалином и залитые парафином (FFPE) ткани представляют собой обширный и ценный банк материалов пациентов для сбора анамнеза и данных последующего наблюдения. Достичь профиля одноклеточной/ядерной РНК (sc/snRNA) в тканях FFPE по-прежнему сложно. Здесь мы разрабатываем технологию секвенирования snRNA на основе капель (snRandom-seq) для тканей FFPE путем захвата полноразмерных тотальных РНК с помощью случайных праймеров. snRandom-seq демонстрирует незначительную долю дублетов (0,3%), гораздо более высокий охват РНК и обнаруживает больше некодирующих РНК и возникающих РНК по сравнению с современными высокопроизводительными технологиями scRNA-seq. snRandom-seq обнаруживает в среднем >3000 генов на ядро ​​и идентифицирует 25 типичных типов клеток. Более того, мы применяем snRandom-seq к клиническому образцу рака печени человека FFPE и выявляем интересную субпопуляцию ядер с высокой пролиферативной активностью. Наш метод обеспечивает мощную платформу секвенирования мяРНК для клинических образцов FFPE и обещает огромные возможности применения в биомедицинских исследованиях.

Обычные ткани, фиксированные формалином и залитые парафином (FFPE), являются наиболее распространенными образцами, подлежащими архивированию, и представляют собой обширный и ценный банк материалов пациентов для сбора анамнеза, данных последующего наблюдения и т. д.1. Морфология ткани и клеточные детали тканей FFPE хорошо сохраняются для гистопатологии благодаря сшивке формальдегидом между ДНК, РНК и белками. Неизбежно, что необратимые модификации, вызванные фиксацией формалином макромолекул в образцах FFPE, всегда затрудняют применение молекулярной биологии. Недавние исследования добились большого прогресса в профилировании транскрипции в образцах FFPE с помощью оптимальных методов экстракции РНК2 или пространственного профилирования in situ3. За последние несколько лет методы высокопроизводительного секвенирования РНК отдельных клеток/ядер (scRNA/snRNA-seq) произвели революцию во всей области биомедицинских исследований4,5,6. Мы создали первый атлас клеток человека и мыши с помощью наших индивидуальных высокопроизводительных платформ scRNA-seq7,8. Считается, что точная транскриптомная характеристика каждой отдельной клетки в клинических образцах FFPE способна обеспечить лучшее понимание клеточной гетерогенности и динамики популяции, тем самым улучшая точность диагностики, лечения и прогноза заболеваний человека. Однако как выделение одиночных интактных клеток/ядер, так и захват РНК из тканей FFPE по-прежнему остаются сложными из-за перекрестного сшивания, модификации и деградации РНК.

В настоящее время большинство популярных высокопроизводительных платформ sc/snRNA-seq, таких как 10X Genomics Chromium Single Cell 3' Solution, полагаются на олиго(dT) для захвата поли(А)+ РНК, так что в основном зрелая информационная РНК (мРНК) будет быть обнаружены, а не неполиаденилированные РНК для анализа. Кроме того, эти методы sc/snRNA-seq на основе олиго(dT) в основном ограничиваются свежими или свежезамороженными образцами, поскольку праймеры oligo(dT) обычно не работают на деградированных РНК. Для решения этих проблем с разных точек зрения были разработаны различные методы. SMART-seq-total9 и VASA-seq10 захватывают как полиаденилированные, так и неполиаденилированные транскрипты, применяя дополнительный этап связывания всех молекул РНК с поли(А). С другой стороны, сообщалось, что SPLiT-seq11 успешно использовался в фиксированных клетках с использованием случайного праймера, который был более эффективным и более широким для захвата тотальных РНК12,13. Однако эти методы еще не были применимы для тканей FFPE. Два метода, недавно опубликованные на сайте bioRxiv, snPATHO-Seq14 и snFFPE-seq15, предоставили оптимизированные методы выделения одиночных интактных ядер из тканей FFPE для выполнения секвенирования мяРНК, что демонстрирует возможность секвенирования мяРНК в тканях FFPE и открывает новые возможности. из этих сложных в использовании образцов. snPATHO-Seq основан на технологии 10X Genomics на основе зондов, поэтому можно обнаружить только ограниченное количество генов14. snFFPE-seq использует платформу 10X Genomics на основе поли(А), которая недостаточно чувствительна для захвата РНК низкого качества из тканей FFPE15. На практике для идентификации прогностических биомаркеров или редких типов клеток всегда требуется крупномасштабное и комплексное транскриптомное профилирование клинических образцов. Таким образом, главная цель состоит в том, чтобы иметь подход, который может удовлетворить потребность в высокопроизводительном, высокочувствительном и широком охвате секвенирования мяРНК на тканях FFPE.