Oct 23, 2023
НПАС4
Природа том 614, стр.
Nature, том 614, страницы 732–741 (2023 г.) Процитировать эту статью
29 тысяч доступов
2 цитаты
215 Альтметрика
Подробности о метриках
Нейрональная активность имеет решающее значение для ремоделирования адаптивных цепей, но представляет собой неизбежный риск для стабильности генома на протяжении долгой жизни постмитотических нейронов1,2,3,4,5. Неизвестно, приобрели ли нейроны специализированные механизмы защиты генома, которые позволяют им противостоять десятилетиям потенциально вредных стимулов в периоды повышенной активности. Здесь мы идентифицируем зависимый от активности механизм репарации ДНК, при котором новая форма модификатора хроматина NuA4-TIP60 собирается в активированных нейронах вокруг индуцибельного, специфичного для нейронов транскрипционного фактора NPAS4. Мы очищаем этот комплекс от мозга и демонстрируем его функции по выявлению зависимых от активности изменений в транскриптомах и схемах нейронов. Характеризуя картину двухцепочечных разрывов ДНК в головном мозге, вызванных активностью, мы показываем, что NPAS4-NuA4 связывается с рекуррентно поврежденными регуляторными элементами и задействует дополнительные механизмы репарации ДНК для стимуляции их восстановления. Генные регуляторные элементы, связанные NPAS4–NuA4, частично защищены от возрастного накопления соматических мутаций. Нарушение передачи сигналов NPAS4-NuA4 приводит к каскаду клеточных дефектов, включая нарушение регуляции зависимых от активности транскрипционных ответов, потерю контроля над нейрональным торможением и нестабильность генома, что приводит к сокращению продолжительности жизни организма. Кроме того, сообщается, что мутации в нескольких компонентах комплекса NuA4 приводят к нарушениям нервного развития и расстройствам аутистического спектра. В совокупности эти результаты идентифицируют нейронально-специфичный комплекс, который напрямую связывает активность нейронов с сохранением генома, нарушение которого может способствовать нарушениям развития, нейродегенерации и старению.
Сенсорный опыт необходим для правильного созревания нейронов и пластичности цепей1. Сигнальные каскады, инициируемые нейрональной активностью, обусловленной опытом, завершаются индукцией генных программ, которые контролируют различные процессы, такие как рост дендритов и синапсов, устранение синапсов, рекрутирование тормозной нейротрансмиссии и адаптивную миелинизацию6,7. Однако активность нейронов также угрожает целостности генома постмитотических нейронов, которые должны выжить на протяжении всей жизни организма. Например, повышенные метаболические потребности в периоды повышенной активности могут увеличить окислительное повреждение активно транскрибируемых участков генома8. Транскрипция, индуцированная активностью, сама по себе представляет дополнительную угрозу стабильности генома, поскольку она связана с индукцией повторяющихся двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) в регуляторных элементах, таких как промоторы стимул-индуцируемых генов2,3,4,5 ,9,10. Хотя сопряжение транскрипции с разрывами ДНК наблюдается в разных типах клеток, этот процесс представляет собой особую проблему для долгоживущих нейронов, которые не могут использовать зависимые от репликации пути репарации ДНК и обладают ограниченными регенеративными механизмами для замены поврежденных клеток11. Накопление повреждений ДНК в геномах нейронов является кардинальной особенностью нейродегенеративных заболеваний и старения организма12,13. Таким образом, понимание стратегий, которые нейроны используют для предотвращения и восстановления повреждений, может иметь прямое влияние на человеческое долголетие и методы лечения старения. До сих пор нет примеров механизмов восстановления нейронов, которые снижали бы риск нестабильности генома во время повышенной активности. Исследуя особенности зависимой от активности транскрипционной программы, специфичной для нейронов, мы обнаруживаем биохимическую связь активности нейронов с репарацией ДНК посредством ранее неизвестной формы комплекса ремоделирования хроматина NuA4 – репарации ДНК, который собирается вокруг индуцируемого, специфичного для нейронов транскрипционного фактора. НПАС4.
В отличие от большинства индуцируемых активностью транскрипционных факторов, которые широко экспрессируются и индуцируются различными стимулами, NPAS4 избирательно экспрессируется в нейронах после передачи сигналов кальция, индуцированной деполяризацией мембраны14. Чтобы понять функции этого фактора, который специально настроен на активность нейронов, мы попытались очистить NPAS4-содержащие белковые комплексы из мозга взрослых мышей. Мы предположили, что NPAS4 может собираться в мультисубъединичный комплекс, который расширяет свою биохимическую активность в активированных нейронах. Используя эксклюзионную хроматографию и неденатурирующий гель-электрофорез, мы обнаружили, что NPAS4 находится в высокомолекулярном комплексе с массой около 1 МДа. Поскольку прогнозируемый размер NPAS4 с любым из его гетеродимерных партнеров (ARNT1 и ARNT2) составляет около 175 кДа, это открытие предполагает, что NPAS4 взаимодействует с множеством неизвестных белков-партнеров (расширенные данные, рис. 1a).
0, adjusted P < 0.1 and that are within Q4 of NPAS4 IgG-normalized CUT&RUN signals are indicated in blue. Right inset, IGV tracks of aggregate sBLISS-seq (n = 8 individual mice) and NPAS4 CUT&RUN (n = 5 pools of 3–5 mice) at Cgref1 and Rgs7bp promoters. Coloured bars represent statistically defined peaks. f, Aggregate plots showing sBLISS-seq coverage (fragment depth per bp per peak) at activity-inducible regulatory elements, subset by quartiles of NPAS4 binding. Signals are mean ± s.e.m. (n = 8 individual mice). ***P < 2.2 × 10−16. P values were calculated using the average signal extracted in a 500 bp window around the element centre using unpaired, two-tailed Wilcoxon rank-sum tests./p> Cre). b, Line plot depicting average ± s.e.m. of sBLISS-seq normalized counts in Cre-infected or ΔCre-infected hippocampi of Npas4fl/fl mice, subset by quartiles of NPAS4 binding. Q1 = 1,017 sites, Q4 = 764 sites. Data from n = 5 each for Cre-infected and ΔCre-infected mice. ***P < 2.2 × 10–16. P values were calculated using unpaired, one-tailed Wilcoxon rank-sum tests (Cre > ΔCre). See Extended Data Fig. 12a for boxplot distribution of data. c, Genome-wide breaks in hippocampal nuclei isolated from Npas4fl/fl (n = 5) or wild-type (n = 3) mice infected with Cre or ΔCre virus. Data are mean ± s.e.m. Npas4fl/fl: 0 h, P = 5.24 × 10–6; 2 h, P = 0.044; 10 h, P = 0.022. Wild-type: 2 h, P = 0.906. P values were calculated using two-tailed, unpaired t-tests. d, Collection of hippocampal neuronal nuclei across lifespan. e,Normalized mutation frequency at NPAS4-bound and unbound sites in wild-type mice. Mutation frequency (base changes and insertions and deletions) with age was calculated per site and normalized to the median frequency for that site in young animals. Points represent the normalized rate for one site sampled from one mouse. Data are mean ± s.e.m. Data are from n = 4 (young), 4 (middle aged) and 3 (old) mice. No NPAS4 sites: mid–young, *P = 0.03; old–young, *P = 0.016. NPAS4-bound sites: mid–young, NS = 0.18; old–young, **P = 0.0095. P values calculated using one-tailed, unpaired t-tests. f, Survival of Npas4 wild-type (n = 53; 28 females, 25 males) and Npas4 knockout (n = 64; 37 females, 27 males) mice, showing abbreviated lifespan of Npas4 knockout mice. P = 4.09 × 10–13 by a two-tailed Mantel–Cox test, P = 3.63 × 10–11 by a two-tailed Gehan–Breslow–Wilcoxon test./p>/J (Jackson Laboratory, 021039)53; and B6.Cg-Tg(Camk2a-cre)T29-1Stl/J (Jackson Laboratory, 005329)54. Mice were housed in a temperature and humidity-controlled environment using ventilated microisolator cages. Mice were kept under a standard 12 h light–dark cycle, with food and water provided ad libitum. Male and female littermate mice were used in similar proportions and divided between control and experimental groups for all experiments conducted. No statistical methods were used to predetermine sample sizes. For biochemistry and genomic experiments, animals were collected at 4–6 weeks of age throughout the manuscript. For physiology experiments, animals were dissected and patched at postnatal day 24 (P24) to P28. For ageing experiments, animals were collected at 3-4 months, 12 months and 23–27 months of age. Details of animal age and sex are detailed within each protocol./p>30% infected CA1 pyramidal neurons were not used for recordings. Slices were also discarded if Cre-mCherry expression was observed in the CA3 or dentate gyrus regions./p>25 KU (1 µl per 10 million nuclei)) followed by the addition of NaCl to a final concentration of 300 mM. Following high-speed centrifugation to remove insoluble material, lysates were diluted to achieve a final salt concentration of 200 mM. To preclear nonspecific interactions, lysates were incubated for 30 min at 4 °C with 50 µl of ms-IgG-coated agarose beads (Sigma-Aldrich, A0919). Following preclear, lysates were incubated for 1.5 h with 60 µl of anti-M2-Flag resin (Sigma-Aldrich, A2220) per 1 ml of diluted lysate. Samples were washed 4× in NE1 buffer containing 250 mM NaCl for 5 min with rotation at 4 °C. NPAS4-interacting or ARNT2-interacting proteins were competitively eluted off M2 resin by incubation in 50–100 µl of 500 µg ml–1 3× Flag peptide (Sigma-Aldrich, F4799) diluted in NE1 buffer for 30 min at room temperature. For mass spectrometry analysis, eluted proteins were precipitated with trichloroacetic acid. Replicates shown in Fig. 1c consisted of 3 independent pools of 8–12 mice collected from wild-type or Npas4–FH lines and processed on separate days. Validation immunoprecipitation assays using either Npas4–Flag-HA mice or Tip60-H3F mice followed by immunoblotting analysis were conducted under the same conditions as described above. For validation experiments in mouse visual cortex following light stimulation, 20 hippocampi were isolated from the V1 cortices of Npas4–Flag-HA or wild-type controls. Mice were housed in the dark for 1 week followed by 2 h of light stimulation. Data are shown in Extended Data Fig. 1f./p> 1 were removed from further analysis. The voom and limma (edgeR_3.28.1;limma_3.42.2) analysis software packages were used to quantify differential gene expression (requiring FDR-corrected q < 0.01). For analysis of the paired RNA-seq samples that matched sBLISS-seq, the DeSeq2 package was used to generate normalized counts. After running a standard DeSeq2 pipeline, normalized counts were generated with the function counts(dds, normalized=TRUE)59./p>100. For information on primer pooling and the amplicons included in the final analysis, see Supplementary Table 5./p>A/(G>T)) divided by the total number of the given base included in the amplicon. Because it is not possible to know on which strand a mutation occurred, complementary base changes were collapsed into a single category (for example, C>T was combined with G>A). Insertion and deletion frequency was also calculated as a separate category. We also calculated a per amplicon normalized mutation rate in which we divided the total mutation rate for each animal by the median total mutation frequency in young mice. For ageing gradient samples, wild-type mice aged 3 months old were considered young, 12 months old were considered middle aged and 23–27 months old were considered old. Extreme outlier points of both normalized mutation frequency and non-normalized frequency were removed across all samples using a ROUT's test at 0.1% confidence (Fig. 5e and Extended Data Fig. 13g). Outlier removal and statistical tests on mutational samples were performed in Prism (v.8.4.2)./p> 
Русский
English
Français
Deutsch
Español
Italiano
Português
日本語
한국어
Дом