Блог

Apr 30, 2023

Протоколы диссоциации слизистой оболочки кишечника влияют на пропорции типов клеток и отдельные

Научные отчеты, том 12,

Том 12 научных отчетов, номер статьи: 9897 (2022) Цитировать эту статью

4471 Доступов

4 цитаты

3 Альтметрика

Подробности о метриках

Секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) произвело революцию в изучении клеточного ландшафта органов. Для большинства одноклеточных протоколов требуется свежий материал, что ограничивает размер выборки на эксперимент и, следовательно, приводит к эффекту пакетной обработки. Это особенно актуально для образцов, полученных с помощью сложных медицинских процедур, таких как биопсия слизистой оболочки кишечника. Более того, процедура диссоциации ткани, необходимая для получения отдельных клеток, является основным источником шума; Различные процедуры диссоциации, применяемые к различным компартментам ткани, вызывают искусственные различия в экспрессии генов между подмножествами клеток. Чтобы преодолеть эти проблемы, мы разработали одноэтапный протокол диссоциации и продемонстрировали его использование на криоконсервированных биопсиях слизистой оболочки кишечника. Используя проточную цитометрию и анализ scRNA-seq, мы сравнили этот одноэтапный протокол диссоциации с текущим золотым стандартом, двухэтапным расщеплением коллагеназой и адаптацией недавно опубликованного альтернативного трехэтапного холодоактивного расщепления протеазой Bacillus licheniformus. Как жизнеспособность клеток, так и состав типов клеток были сопоставимы при одноэтапной и двухэтапной диссоциации коллагеназы, причем первый вариант был более эффективным по времени. Холодное расщепление протеазой привело к равной жизнеспособности клеток, но лучше сохранило типы эпителиальных клеток. Следовательно, для анализа более редких типов клеток, таких как глиальные клетки, в качестве входного материала требуется большее общее количество клеток биопсии. Многоэтапные протоколы по-разному влияли на типы клеток, охватывающие несколько отсеков. Таким образом, мы показываем, что криоконсервированные биопсии слизистой оболочки кишечника могут быть использованы для преодоления логистических проблем и пакетных эффектов в крупных исследованиях scRNA-seq. Кроме того, мы демонстрируем, что использование криоконсервированных биопсий, переваренных с использованием одноэтапного протокола коллагеназы, позволяет проводить крупномасштабное секвенирование scRNA, FACS, генерацию органоидов и расширение внутриэпителиальных лимфоцитов.

Несмотря на то, что первая кДНК была извлечена из одной клетки более 30 лет назад1, лишь совсем недавно технологические разработки в области секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) позволили определить профили экспрессии генов в одной клетке. с высокой пропускной способностью2. Эта разработка позволяет объективно изучать гетерогенные популяции клеток в тканях без необходимости отдельного выделения типов клеток. Помимо картирования клеточной экспрессии, это позволяет изучать потенциальные межклеточные взаимодействия в контексте ткани3.

В настоящее время во всем мире предпринимаются попытки составить карту человеческого тела с разрешением отдельных клеток как для здоровья (Атлас человеческих клеток4), так и для болезней (консорциум LifeTime5). Одной из областей, в которой уже предпринимаются большие усилия, является гастроэнтерология; Создаются (в настоящее время) атласы «здорового» кишечника плода, ребенка и взрослого человека6,7. Это привело к идентификации новых типов клеток и их специфических функций, таких как эпителиальные клетки BEST4, участвующие в чувствительности к pH8, и дало первые сведения о том, почему некоторые пациенты с болезнью Крона не реагируют на определенные лекарства9.

Слизистая оболочка кишечника представляет собой сложный орган, который можно разделить на несколько отделов: эпителиальный слой, расположенный в просветной части; и слой собственной пластинки, лежащий под эпителием. Каждый компартмент состоит из смеси типов клеток, которые могут иметь специализированные и локальные функции и по-разному распределяются по желудочно-кишечному тракту10,11. На просветной стороне слизистая оболочка кишечника состоит из а-клеточного слоя слизи, отделяющего кишечные бактерии от эпителия. Этот слой функционирует как второй барьер между внешним миром и внутренним отделом кишечника. Непосредственно под ним находится эпителиальный слой, в который проникают иммунные клетки и выполняют специфические функции антимикробной защиты и передачи сигналов антигена. Одной из этих популяций иммунных клеток, которая находится только здесь, является популяция интраэпителиальных лимфоцитов (IEL), которая функционально отличается от лимфоцитов в собственной пластинке (LPL), нижележащем слое. Последний слой также содержит другие иммунные клетки, сосудистую сеть, нервы и мезенхимальные клетки12,11,14.